现代生物技术★ღღღ◈，尤其是合成生物学的快速发展★ღღღ◈，使得我们能够通过基因改造赋予植物新的性状凯发K8娱乐官网app下载★ღღღ◈。植物基因组的精确修饰可以通过同源重组或基因编辑实现★ღღღ◈，而新基因也可以通过随机整合的方式导入植物基因组★ღღღ◈。然而★ღღღ◈，在高等植物中凯发K8娱乐官网app下载★ღღღ◈，通过同源重组进行基因靶向（gene targeting）修饰的效率通常极低山东12530山东12530★ღღღ◈，这成为精确修饰植物基因组的主要障碍之一★ღღღ◈。农杆菌介导的T-DNA随机整合到植物基因组是一种常用的基因导入工具★ღღღ◈，但筛选转基因植物需要使用选择标记（selection marker）山东12530★ღღღ◈，而公众对选择标记可能对人类健康造成的潜在风险表示担忧★ღღღ◈。目前★ღღღ◈，欧盟超过一半的国家已正式禁止转基因（genetically modified）作物的种植★ღღღ◈。因此★ღღღ◈，开发无选择标记的DNA导入技术对于安全转基因应用具有重要意义凯发K8娱乐官网app下载★ღღღ◈，相关研究也备受关注★ღღღ◈。尽管已有多种策略被探索★ღღღ◈，如共转化★ღღღ◈、转座元件和位点特异性重组等★ღღღ◈，但这些方法通常操作繁琐且效率不高★ღღღ◈。
该研究开发了一种基于CRISPR/Cas9技术的简化高效系统★ღღღ◈，称为Transgenic Selection-Associated Fragment Elimination（T-SAFE）系统（图1）★ღღღ◈。T-SAFE系统由四个模块组成★ღღღ◈：选择标记★ღღღ◈、CRISPR/Cas9★ღღღ◈、间隔序列加原间隔序列相邻基序（SP）和目标DNA★ღღღ◈。其中★ღღღ◈，选择标记和CRISPR/Cas9模块合称为SCC★ღღღ◈。SCC两侧是两个源自果蝇Ebony基因的相同SP序列★ღღღ◈，这些序列能够在外源DNA整合到植物基因组时★ღღღ◈，有效引导Cas9切割包含选择标记基因的SCC★ღღღ◈，从而实现选择标记的自我消除★ღღღ◈。此外★ღღღ◈，为了抑制细菌中功能性Cas9蛋白的产生★ღღღ◈，研究团队将马铃薯ST-LS1基因的IV2内含子整合到Cas9基因中★ღღღ◈；同时★ღღღ◈，为了避免在非生殖植物细胞中发生SCC切割凯发K8娱乐官网app下载★ღღღ◈，Cas9基因由生殖细胞特异性启动子或诱导型启动子驱动★ღღღ◈。这些创新设计使T-SAFE系统在拟南芥转基因植物中选择标记的消除效率达到10-30%★ღღღ◈，在水稻中达到5-8%★ღღღ◈，且DNA递送能力超过10 kb★ღღღ◈。这一方法为植物基因改造提供了一种安全可靠的新途径★ღღღ◈。
图1. T-SAFE系统示意图★ღღღ◈。（A）T-SAFE系统由四个模块组成★ღღღ◈：选择标记（selection marker）★ღღღ◈、CRISPR/Cas9★ღღღ◈、SP和目标DNA（Target）★ღღღ◈。（B）DNA整合到植物基因组后★ღღღ◈，sgRNA引导Cas9有效切割SCC两端的SP★ღღღ◈。（C）自我消除SCC后★ღღღ◈，无选择标记的目标DNA成功地送到植物基因组★ღღღ◈。引物对F1/C-R和F2/C-R分别用于检测植物中整合片段是否含有SCC★ღღღ◈。采用TAIL-PCR扩增整合片段侧翼的植物基因组序列凯发K8娱乐官网app下载★ღღღ◈。根据TAIL-PCR结果凯发K8娱乐官网app下载★ღღღ◈，设计了两对引物PG-F/C-R和PG-F/PG-R★ღღღ◈，用于鉴定基因组DNA片段与SCC切割后的目标DNA片段的整合情况★ღღღ◈。
上海师范大学生命科学学院卓越创新班本科生杨奕为论文第一作者★ღღღ◈，王水研究员为通讯作者★ღღღ◈。实验室研究生常欢山东12530★ღღღ◈、潘镭文★ღღღ◈、郭东北★ღღღ◈、彭顺★ღღღ◈、毛婷和张悦慧等同学参与了本项研究★ღღღ◈。相关工作得到了国家自然科学基金委和上海市植物种质资源开发协同创新中心等项目的资助山东12530★ღღღ◈。凯发在线网站k8凯发官方app下载★ღღღ◈，天生赢家★ღღღ◈，基因改造★ღღღ◈，
